Клевезаль Г.А. Клейненберг С.Е.
"Определение возраста млекопитающих"
(по слоистым структурам зубов и кости)
М.: Наука, 1967 г.

ГЛАВА 2
МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ГОДОВЫХ СЛОЕВ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ВОЗРАСТА МЛЕКОПИТАЮЩИХ

МЕТОДИКА ОБРАБОТКИ ДЕНТИНА И ЦЕМЕНТА ЗУБОВ

Для определения возраста по числу слоев в дентине пригоден любой коллекционный материал. Годовые слои и в дентине, и в цементе видны одинаково хорошо независимо от того, хранился зуб в формалине, в спирте или в сухом виде.

Дентин. Подсчет годовых слоев в дентине можно проводить на продольном или поперечном шлифе (или срезе) зуба. Продольный шлиф (или срез) через середину зуба годится для подсчета слоев в зубах с любым типом роста, но он дает менее четкую картину и готовить его труднее, чем поперечный шлиф. Если зуб рано прекращает рост в длину, подсчет слоев можно вести на поперечном срезе через середину зуба, поскольку такой срез захватывает все годовые слои. Поперечный срез зуба, имеющего длительный рост в длину, в котором наслоение дентина идет под углом к продольной оси зуба, захватит только часть годовых слоев, на каком бы уровне он ни был сделан. Для определения возраста по дентину зубов такого типа нужно делать продольные шлифы (или срезы).

Часто годовые слои дентина отчетливо видны на аншлифах зуба (зашлифованная поверхность сечения половинки зуба) в отраженном свете или на тонких шлифах в проходящем свете. Для получения аншлифа зуб можно либо резать вручную и затем зашлифовать поверхность среза, либо просто сточить лишнюю часть зуба на механическом точильном камне и дошлифовать поверхность вручную. Для получения тонких шлифов ручным способом нужно вырезать пластинку зуба (можно пользоваться лобзиком с пилкой по металлу) и шлифовать сначала на крупнозернистых, а затем на мелкозернистых камнях, прижимая пластинку корковой пробкой. Для удобства шлифования пластинку можно приклеить к пробке.

Вероятно, можно использовать для этого желатиновый клей, описанный в разделе о методике обработки кости. Мы пользовались другим способом.

Зашлифовав одну сторону пластинки, помещали ее на ровную поверхность корковой пробки и сверху заливали целлоидиновым клеем (для таких целей годится отмытая от эмульсии ацетатная пленка, растворенная в ацетоне). После того как клей затвердевал, начинали шлифовку, сошлифовывая зуб вместе с окружающим его твердым клеем. Шлиф удерживается на пробке только окружающим его с боков клеем, и потому, как только шлиф станет достаточно тонким, он легко вынимается (или даже выпадает) из своего гнезда. (В том случае, если клей попадет на нижнюю поверхность шлифа и приклеет его к пробке, готовый шлиф можно освободить, опустив пробку в ацетон.)

В любом случае ручное приготовление тонких шлифов очень трудоемко, поэтому его лучше механизировать. Фишер и Макензи описывают конструкцию станка, позволяющего получить шлиф толщиной 100 мк за 1 мин. Для механической шлифовки необходимо, чтобы зуб с момента гибели зверя сохранялся влажным, так как сухие зубы становятся хрупкими (Фишер и Макензи предлагают хранить зубы в растворе спирт — глицерин — тимол). Предварительный срез пластинки зуба делается ювелирной пилой из углеродистой стали (0,020 X 3 дюйма, с 24 зубцами на дюйм), вращающейся со скоростью 2400 об /мин от мотора в четверть лошадиной силы. Шлифовка пластинки производится двумя одинаковыми круглыми мелкопесчаными карборундовыми камнями, вмонтированными в станок типа токарного. Один камень прикреплен к головному стволу и вращается от мотора в четверть лошадиной силы, другой неподвижно закреплен на хвостовом стволе; хвостовой ствол свободно движется вдоль станины. Камни снабжены латунными муфтами. Через кран на вершине неподвижной муфты поступает вода и вытекает через выпускное отверстие на дне (оно перекрывается краном, чтобы избежать потери шлифа). Под муфтами имеется специальное приспособление для сбора воды, которая разбрызгивается во время шлифовки. Вмонтированный в хвостовой ствол микрометр и неподвижно укрепленный на станине стопор дают возможность поставить камни на любое заданное расстояние друг от друга.

Пластинку зуба прикладывают к мокрой поверхности любого из камней и придвигают хвостовой ствол так, чтобы камни стали вплотную к пластинке с обеих сторон. При шлифовке хвостовой ствол включается вместе с машиной и медленно движется к стопору. Таким методом можно приготовить шлиф толщиной даже 25 мк, но оптимальной толщиной шлифа для определения возраста гренландского тюленя Фишер и Макензи считают 100 мк.

Карик и Ингем пришли к выводу, что слои на аншлифах клыков морского слона становятся более отчетливыми, если поверхность обработать азотнокислым серебром. Они помещали половинку зуба на ночь в 5%-ный раствор азотнокислого серебра, затем промывали и экспонировали на свету до тех пор, пока поверхность не становилась несколько более темной, чем нужно (длительность экспозиции не превышала 10 мин.). Затем зуб фиксировали в течение 10 мин. в 10%-ном растворе тиосульфата натрия и в течение часа промывали в проточной воде. В результате годовые слои выглядят как чередующиеся темные и светлые полосы.

Боу и Пьюдей предложили увеличивать четкость слоев дентина в зубах кашалота посредством обработки аншлифов кислотой. (Этот метод сходен с тем, что применял Новаковский для улучшения четкости слоев в цементе бизона, о чем см. ниже.) Они пробовали обрабатывать зуб соляной, азотной и муравьиной кислотами различной концентрации и установили, что наилучший результат получается при использовании 5% -ной муравьиной кислоты. Поверхность ашнлифа зуба помещали в эту кислоту на 30 час., затем промывали и высушивали. Вся обработка велась при комнатной температуре. В результате темные и светлые полосы годовых слоев выглядели как валики и борозды. В процессе обработки кислотой трудно установить, каков будет конечный результат, так как валики и борозды выступают только после высушивания. Если они видны плохо, всю обработку нужно повторить сначала.

Г. А. Федосеев (1964) считает более удобным определять возраст кольчатых нерп не по шлифам или аншлифам клыка, а по неокрашенным срезам с декальцинированного зуба. Он помещал целый клык в 10 — 12%-ный раствор азотной кислоты примерно на сутки или немного дольше. После того как зуб становился мягким, срез можно было делать обыкновенной бритвой. Преимущество такого метода в том, что он позволяет обработать большое число зубов в короткий срок без применения сложной аппаратуры. Как показал наш опыт, подсчет слоев на таких срезах у некоторых видов млекопитающих (например, у полосатого тюленя-крылатки) затрудняется тем, что очень четко выявляющиеся при этом дополнительные полоски мешают правильно разграничить годовые слои.

У многих млекопитающих годовые слои в дентине плохо видны как на аншлифах, так и на тонких шлифах, но очень хорошо выявляются на препаратах, окрашенных гематоксилином. Сержант (1959) декальцинировал тонкие шлифы зубов зубатых китов в 70°-ном спирте с 5% соляной кислоты и после промывки окрашивал их гематоксилином Делафильда. Очевидно, что проще декальцинировать не тонкий шлиф, а весь зуб или кусок зуба и затем получить тонкий срез.

Для декальцинации зуба вполне пригоден один из наиболее распространенных декальцинатов — 5—7%-ный раствор азотной кислоты.

Зуб можно декальцинировать либо целиком (зубы мелких млекопитающих — вместе с участком челюсти), либо кусок. Время декальцинации варьирует в зависимости от величины и плотности зуба от 5—6 час. (зубы бурозубок — вместе с челюстью) до 1—3 суток (зубы хищных, копытных). Мягкий декальци-нированный зуб нужно промыть в проточной воде в течение 10— 24 час. Далее обработка может идти любым принятым в гистологии методом с заливкой в парафин, целлоидин, желатину и т. д.— в зависимости от навыка и наличия аппаратуры (см. руководства по микроскопической технике Г. И. Роскина (1951), Б. Ромейса (1953) и др.).

Мы использовали наиболее быстрый и наименее трудоемкий метод — получение срезов на замораживающем микротоме. Промытый зуб или кусок зуба (если декальцинировали всю челюсть с зубами, то нужный кусок вырезается бритвой после декальцинации) резали на замораживающем микротоме в нужной плоскости на срезы 15—30 мк. Полученные срезы помещали в дистиллированную воду, затем окрашивали гематоксилином Эрлиха (мы пробовали красить также гематоксилином Карачи и гемалауном, но нашли, что гематоксилин Эрлиха дает наилучшую картину), промывали в проточной воде, проводили по глицеринам возрастающей концентрации и заключали в чистый глицерин.

На таких препаратах годовые слои состояли из узких интенсивно окрашенных и широких слабо окрашенных полос.

Время окрашивания варьируют в зависимости от характера красителя.

После окраски срезы нужно дифференцировать —поместить на несколько секунд в бюкс 70°-ным спиртом, куда добавлены 2—3 капли соляной кислоты, и затем быстро перенести в воду. При окраске с дифференцировкой слои выявляются значительно более четко, чем без дифференцировки. После дифферен-цировки срезы нужно промывать 10—15 мин. в проточной воде или 30—60 мин. в часто сменяемой воде. Для того чтобы срезы не коробились, их после промывки нужно помещать сначала в 25%-ный, затем в 50 и 75%-ный раствор глицерина в воде. В каждом растворе срезы находятся не менее 5—10 мин. Крупные срезы можно переносить по всем растворам препаровальной иглой, слегка согнутой в середине. Очень мелкие срезы, например поперечные срезы клыков летучих мышей, лучше поместить в маленький сосуд, в дне и боковых стенках которого имеются многочисленные отверстия, и далее переносить сосуд со срезами из воды в краску, в воду для промывки, в глицерины. С одного зуба лучше брать не один, а несколько срезов, окрашивать и проводить их вместе и заливать на одном стекле.

При заключении препаратов в глицерин получаются так называемые временные препараты, поскольку со временем в глицерине гематоксилин разлагается. Как показал опыт, такие препараты сохраняются в удовлетворительном (для определения числа слоев) виде в течение 2—3 лет.

Преимущество временных препаратов в том, что если при исследовании готового препарата оказалось, что он плохо окрашен или плохо промыт, то его легко вынуть, положить в воду, снова тщательно промыть или даже перекрасить (для этого его из воды поместить в спирт с соляной кислотой до полного обесцвечивания, тщательно промыть и снова окрасить гематоксилином) и опять заключить в глицерин. Недостатком заключенных в глицерин препаратов является то, что их можно хранить только в горизонтальном положении на планшетках. Для получения препаратов, более удобных для хранения или перевозки, их можно после проведения по глицеринам заключить в глицерин — желатину или заключить в глицерин и окантовать (см. руководства по микроскопической технике).

Цемент. Цемент отлагается не однородно на поверхности корня зуба: он может быть на одной боковой стороне корня развит значительно больше, чем на противоположной (таков характер цемента на резцах у куланов и пятнистых оленей), может отлагаться главным образом на нижней поверхности корня (как, например, у бобра (Клейненберг, Клевезаль, 1966), часто он достигает большей толщины в межкорневой подушке, чем на корнях (например, в коренных зубах оленей) . В большинстве случаев для определения возраста по цементу зубов приходится делать продольные срезы (или шлифы). Для правильной ориентировки следует предварительно сделать поперечный шлиф, чтобы выяснить, нет ли различий в толщине отложений цемента на боковых стенках корня.

Поперечные срезы можно использовать только в тех случаях, когда отложение цемента на боковых стенках корня идет не намного менее интенсивно, чем на нижней поверхности. В этих случаях (например, в клыках тюленей, имеющих ограниченный рост в длину) на срезах, прошедших через середину или верхнюю треть корня, будут видны все годовые слои.

Иногда годовые слои в цементе отчетливо видны на аншлифах зуба в отраженном свете. Такую картину мы наблюдали у бобра и пятнистого оленя. Новаковский использовал следующий метод для улучшения четкости слоев цемента на аншлифах зубов бизона: зашлифованную ручным способом поверхность разрезанного вдоль корня он помещал на 2 часа в декальцинирующий раствор (5% соляной кислоты и 95% спирта), промывал и сушил в течение ночи; в результате образовывались валики вследствие неравной декальцинации непрозрачных и прозрачных полос годового слоя цемента. Мы обработали таким образом аншлифы зубов бобра, но не нашли существенного улучшения четкости годовых слоев.
Хьюер подсчитывал слои в цементе клыков серого тюленя на тонких шлифах в проходящем свете.

Мунди и Фулер для подсчета годовых слоев в цементе зубов медведя-гризли делали продольный срез недекальцинированного зуба толщиной 150 мк с помощью специальной машины для резки кости и зуба (авторы приводят только адрес фирмы, выпускающей машины), срез обезвоживали в спирте, просветляли в ксилоле и заключали в канадский бальзам.

Макэуэн отмечает, что слои цемента не были видны на шлифах резцов карибу ни в проходящем, ни в отраженном свете, но отчетливо выявлялись на срезах декальцинированного зуба, окрашенных гематоксилином. То же самое мы наблюдали в клыках калана. Годовые слои цемента в зубах мелких млекопитающих можно, очевидно, считать только на окрашенных срезах, так как трудно сделать шлиф мелких зубов в нужной плоскости.

Окрашенные препараты цемента можно получать точно таким же методом, как и препараты дентина (см. выше). Как и в случае дентина, четкость слоев увеличивается, если срез несколько перекрасить и потом дифференцировать. На таких препаратах годовые слои видны как чередующиеся узкие, интенсивно окрашенные и широкие, слабо окрашенные полосы.

НазадОглавлениеДалее